一、细胞基本属性（客服：小烽：18030101858）

• 药物筛选：puro（嘌呤霉素）药筛浓度 2.0μg/ml，常规培养建议用 1.0μg/ml puro 维持细胞稳转特性；bsd（博来霉素）药筛浓度 8.0μg/ml，常规培养建议用 4.0μg/ml bsd 辅助维持，防止非稳转细胞污染
• 培养基：90% MEM 培养基 + 10% FBS+PS（严格按配方配制，需额外添加指定浓度 puro/bsd，保障稳转株纯度）

  培养条件：气相 95% 空气 + 5% 二氧化碳，温度 37℃（常规人体上皮细胞培养条件）

  冻存条件：无血清冻存液（推荐 IMC-701），液氮储存

  细胞货期：现货，1 周左右

  运输方式：复苏发货（T25 瓶免运输费用）/ 冻存发货（需加干冰运输费用） 顺丰快递

  供应限制：仅限于科学研究，绝不可作为动物或人类疾病的治疗产品使用

培养核心操作

1. 传代操作（重点维持稳转特性与药物浓度）

• 当细胞密度达 70%-80%（上皮细胞单层铺满瓶壁，无明显堆叠，多边形形态完整）时，弃去旧培养基，用无菌 PBS 轻柔冲洗细胞表面 1 次，避免损伤紧密排列的细胞层。
• 加入胰酶温和消化，待细胞边缘收缩、间隙增大（约 2-3 分钟，HEK293 衍生株消化敏感，需密切观察，防止过度消化导致细胞破碎）后，立即加入含 10% FBS 的 MEM 培养基终止消化（血清可快速中和胰酶活性）。
• 用移液器轻柔吹打细胞至单细胞悬液，按 1:3-1:5 比例接种到新培养瓶，接种后需立即在培养基中添加 1.0μg/ml puro 与 4.0μg/ml bsd，维持稳转株纯度，避免非稳转细胞增殖。

2. 换液操作（重点把控药物浓度与更换频率）

• 每 2-3 天更换 1 次新鲜培养基，换液时需严格按 “90% MEM+10% FBS+PS+1.0μg/ml puro+4.0μg/ml bsd” 配方配制，确保药物浓度精准，防止浓度过高损伤细胞或过低导致稳转丢失。
• 倾倒旧培养基时动作缓慢（避免直接冲击细胞层导致细胞脱落），用 PBS 冲洗 1 次后加入足量新培养基；若开展 TGFB1 激活实验，实验前 12 小时可更换无药培养基，避免药物对实验结果产生干扰。

3. 冻存操作（重点保留稳转与荧光特性）

• 选取对数期（增殖旺盛、上皮形态均一、无杂细胞，稳转荧光信号稳定）的细胞，胰酶消化后 1000rpm 离心 5 分钟，弃上清收集细胞沉淀。
• 用推荐的无血清冻存液（IMC-701）重悬细胞至 1×10⁶-2×10⁶cells/ml，分装到冻存管后，按 “4℃静置 30 分钟→-20℃放置 2 小时→-80℃过夜→转入液氮” 的梯度降温，减少低温对稳转细胞的损伤，保留 TGFBR2 基因与 Nluc 报告基因功能。

4. 复苏操作（重点快速恢复与药物添加）

• 从液氮中取出冻存管，立即放入 37℃水浴速融（1-2 分钟内完全融化，避免冰晶反复冻融破坏细胞与稳转基因），迅速将细胞悬液转移至离心管。
• 加入 5 倍体积新鲜 “90% MEM+10% FBS+PS” 培养基稀释（暂不加药，减少复苏初期细胞应激），1000rpm 离心 5 分钟弃上清，用含 1.0μg/ml puro 与 4.0μg/ml bsd 的预热培养基重悬细胞后接种；复苏后 24 小时观察细胞贴壁与荧光信号，48 小时后按常规换液。

5. TGFB1 激活验证实验配套操作

• 实验前将细胞接种至 6 孔板，待密度达 50%-60% 时，更换含不同浓度 TGFB1 刺激剂的培养基（无药），培养指定时间（参考随货说明书）。
• 收集细胞，通过 QPCR 检测 TGFB1 激活相关基因表达（如截图所示），或通过荧光检测仪器检测 Nluc 荧光信号强度，分析 TGFBR2 通路激活情况；实验过程中需设置空白对照组（无 TGFB1 刺激）与阳性对照组，确保结果可靠性。