细胞培养操作（适配低转移、慢生长特性）

（一）复苏操作

1. 准备工作：提前将培养基（DMEM+10% FBS+1% PS）预热至 37℃，超净工作台紫外线消毒 30 分钟，准备无菌离心管、移液器、T25 培养瓶等耗材。
2. 冻存管融化：从液氮罐取出冻存管，迅速放入 37℃水浴锅，1-2 分钟内完全融化（因细胞生长缓慢，避免融化不彻底导致细胞损伤），期间轻轻摇晃冻存管。
3. 细胞清洗：将融化的细胞悬液缓慢加入含 5mL 预热培养基的离心管，1000rpm 离心 5 分钟，弃上清（去除 DMSO），加入 2mL 新鲜培养基重悬细胞（动作轻柔，减少细胞机械损伤）。
4. 接种培养：将细胞悬液接种至 T25 培养瓶，补充培养基至 5-6mL，轻轻摇匀后放入 37℃、5% CO₂培养箱，48 小时后观察贴壁情况（较 MHCC-97H 延迟 24 小时），弃未贴壁细胞并更换新鲜培养基。

（二）传代操作

1. 传代时机：当细胞密度达到 70%-80%（镜下观察细胞铺满瓶底 70%，因生长慢，避免等待过久导致细胞老化），传代间隔约 4-5 天。
2. 消化处理：弃旧培养基，用无菌 PBS 清洗细胞表面 2 次，加入 1mL 0.25% 胰酶 – EDTA 消化液，37℃孵育 2-3 分钟（较 MHCC-97H 延长 1 分钟，确保细胞完全脱落），镜下见细胞间隙增大、形态变圆时，加入 2mL 含血清培养基终止消化。
3. 细胞收集：轻柔吹打培养瓶壁（避免用力过猛破坏细胞），收集单细胞悬液至离心管，1000rpm 离心 5 分钟，弃上清。
4. 分瓶接种：加入新鲜培养基重悬细胞，按 1:2-1:3 比例分瓶（因生长慢，分瓶比例低于 MHCC-97H，确保传代后细胞密度适宜生长），每瓶补充培养基至 5-6mL，摇匀后放入培养箱。

（二）冻存操作

1. 细胞准备：选择对数生长期（细胞密度 70%）、状态良好的细胞，冻存前 24 小时更换新鲜培养基（因生长慢，提前换液时间延长至 24 小时，确保细胞活力）。
2. 消化收集：参照传代消化步骤，收集单细胞悬液，1000rpm 离心 5 分钟，弃上清，用无血清冻存液重悬细胞，调整浓度至 1×10⁶-5×10⁶cells/mL（适当提高浓度，提升复苏存活率）。
3. 分装冻存：将细胞悬液分装至冻存管（每管 1mL），标记细胞名称、冻存日期、代数，按 “4℃平衡 30 分钟→-20℃放置 2 小时→-80℃过夜→液氮保存” 流程操作，避免直接放入液氮。

（三）注意事项

1. 生长节奏把控：因细胞生长缓慢，需避免频繁观察或移动培养瓶，减少环境波动对细胞的影响；记录每次传代时间及细胞密度，建立专属生长曲线，便于后续实验时间规划。
2. 污染防控：培养周期较长（较 MHCC-97H 长），需加强无菌操作，培养基开封后 4℃保存不超过 1 个月，每周观察细胞形态及培养基状态，发现浑浊或异常立即丢弃。
3. 对比实验适配：与 MHCC-97H 进行高低转移对比实验时，需同步复苏、传代，调整接种密度（建议 MHCC97-L 接种密度略高于 MHCC-97H），确保两株细胞在实验检测时处于同一生理状态，减少误差。
4. 特性维护：每 5 代通过 Transwell 实验验证低转移特性（与 MHCC-97H 对比），确保细胞低转移表型稳定；冻存时按 “每 3 代冻存 1 批” 的频率建立种子库，避免长期传代导致特性漂移。