一、细胞基本属性（客服：小烽：18030101858）

培养核心操作

1. 传代操作

• 当细胞密度达 80%-90%（铺路石样细胞紧密排列，无明显间隙但未堆叠）时，弃去旧培养基，用无菌 PBS 轻柔冲洗细胞表面 1 次，避免冲散紧密排列的细胞层。
• 加入胰酶温和消化，待细胞边缘微微收缩、铺路石样结构出现微小间隙（约 1-2 分钟，需密切观察，避免过度消化）后，立即加专用培养基终止消化。
• 用移液器轻柔吹打细胞至单细胞悬液（内皮细胞脆弱，避免剧烈吹打），按 1:2-1:3 比例接种到新培养瓶，维持其铺路石样形态与永生化活性。

2. 换液操作

• 每 2-3 天更换 1 次新鲜专用培养基，换液时缓慢倾倒旧培养基（防止直接冲击细胞层导致细胞脱落），再用 PBS 冲洗 1 次，最后加入足量培养基覆盖细胞。
• 若发现细胞出现少量脱落，需缩短换液间隔或检查培养基新鲜度，避免代谢废物堆积影响内皮细胞贴壁能力。

3. 冻存操作

• 选取对数期（增殖旺盛、铺路石样形态均一、无杂细胞）的细胞，胰酶消化后 1000rpm 离心 5 分钟，弃上清收集细胞沉淀。
• 用无血清冻存液重悬细胞至 1×10⁶-2×10⁶cells/ml，分装到冻存管后，按 “4℃静置 30 分钟→-20℃放置 2 小时→-80℃过夜→转入液氮” 的梯度降温，减少低温对内皮细胞的损伤。

4. 复苏操作

• 从液氮中取出冻存管，立即放入 37℃水浴速融（1 分钟内完全融化，避免反复冻融），迅速将细胞悬液转移至离心管。
• 加入 5 倍体积新鲜专用培养基稀释，1000rpm 离心 5 分钟弃上清，用预热至 37℃的专用培养基重悬细胞后接种，24 小时后观察细胞贴壁情况，48 小时后按常规换液。